Reprogrammation
Module 1 : Isolation de cellules à partir d’un prélèvement ou d’une biopsie
Module 1A : Isolation de fibroblastes à partir d’une biopsie de peau
Ce service permet d’établir une culture primaire de fibroblastes à partir d’une biopsie cutanée (5 à 10 mm)
et d’obtenir environ 2 à 3 millions de cellules en 1 mois.
Seulement des biopsies cutanées fraîches seront acceptées. Le requérant doit s’engager à adopter nos protocoles de prélèvement et de transport pour la biopsie. Selon notre expérience, les phases de prélèvement et de transport sont des étapes cruciales qui, mal réalisées, pourraient être à l’origine d’une incapacité à isoler des fibroblastes.
Module 1B : Isolation de cellules épithéliales à partir d’un prélèvement d’urine
Ce service permet d’établir une culture primaire de cellules épithéliales d’urine à partir d’un prélèvement d’environ 150 à 200 ml et d’obtenir de 0.5 à 5 millions de cellules en 1 mois.
Le requérant doit s’engager à adopter nos protocoles de prélèvement et de transport pour l’échantillon d’urine. Celui-ci doit être reçu dans un délai maximum de 4 heures pour que les cellules soient viables. Par contre, il est possible qu’un échantillon d’urine ne produise pas de colonies de cellules. Si tel est le cas, un autre prélèvement sera nécessaire.
Module 1C : Isolation de cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC)
Ce service permet d'obtenir en moyenne 1 million de PBMC par ml de sang en moins d'une heure. Le prélèvement doit se faire dans un tube d'héparine de sodium et doit être traité dans un délai de 48h.
Module 2: Reprogrammation cellulaire à partir du virus de Sendai
Si le requérant possède déjà les cellules à être reprogrammées dans son laboratoire, celles-ci peuvent nous être envoyées congelées (un minimum de 500 000 cellules par cryovial est fortement suggéré) ou vivantes dans un flacon de 25 cm2. Les cellules doivent avoir un faible nombre de passages et être capable de proliférer, car les cultures sénescentes ne sont pas facilement reprogrammables (excepté les PBMCs). Aucun cryovial de cellules ne sera conservé au sein de notre laboratoire. Les cellules non utilisées seront retournées au requérant en même temps que les clones d'hiPSC.
Module 2A : Reprogrammation de fibroblastes
Ce service s’étend sur environ 2 à 3 mois et inclut :
- Amplification des cellules, congélation et ensemencement pour la transduction
- Test de mycoplasmes par PCR
- Transduction d’un puits (200 000 à 300 000 cellules/puits) avec le virus de Sendai
- Passage et ensemencement sur MEFs et Matrigel (trois 35mm chaque) et changement de milieu à chaque jour.
- Congélation du surplus de cellules transductées (maximum de 2 cryovials)
- Repiquage 3 semaines plus tard de 5-10 clones/lignée
- Culture et amplification des 3 plus beaux clones au niveau morphologique
- Test de mycoplasmes par PCR
- Congélation de 5 cryovials/clone (Passages 3 et 4)
Module 2B : Reprogrammation de cellules épithéliales d'urine
Ce service s’étend sur environ 2 à 3 mois et inclut :
- Amplification des cellules, congélation et ensemencement pour la transduction
- Test de mycoplasmes par PCR
- Transduction d’un puits (200 000 à 300 000 cellules/puits) avec le virus de Sendai
- Passage et ensemencement sur MEFs et Matrigel (trois 35 mm chaque) et changement de milieu à chaque jour.
- Congélation du surplus de cellules transductées (maximum de 2 cryovials)
- Repiquage 3 semaines plus tard de 5-10 clones/lignée
- Culture et amplification des 3 plus beaux clones au niveau morphologique
- Test de mycoplasmes par PCR
- Congélation de 5 cryovials/clone (Passages 3 et 4)
Module 2C : Reprogrammation de PBMCs
Ce service s’étend sur environ 2 à 3 mois et inclut :
- Ensemencement pour la transduction et congélation du surplus des cellules
- Test de mycoplasmes par PCR
- Transduction d’un puits (250 000 à 500 000 cellules/puit) avec le virus de Sendai
- Passage et ensemencement sur MEFs (trois 35 mm chaque) et changement de milieu à chaque jour.
- Congélation du surplus de cellules transductées (maximum de 2 cryovials)
- Repiquage 2 à 3 semaines plus tard de 5-10 clones/lignée
- Culture et amplification des 3 plus beaux clones morphologiquement
- Test de mycoplasmes par PCR
- Congélation de 5 cryovials/clone (Passages 3 et 4)
Module 2D : Reprogammation à partir d'autres types cellulaires
Il est possible de reprogrammer d'autres types cellulaires non indiqués ci-dessus.
Veuillez contacter Laurie Martineau pour plus d'informations.
Module 3 : Caractérisation
Les résultats obtenus lors de la caractérisation seront envoyés par courriel sous forme de rapport.
Le temps de travail est optimisé sans avoir à redémarrer les cultures.
Module 3A : Immunofluorescence, cytométrie de flux, formation de corps embryoides et expression génique
Ce service s’étend sur environ 1 mois et inclut :
- Immunofluorescence pour les marqueurs de pluripotence : OCT4, Nanog, SSEA4, TRA-1-60 et TRA-1-81
- Cytométrie de flux pour les marqueurs de surfaces TRA-1-60 et TRA-1-81
- Extraction d’ARN, rétro-transcription et PCR classique pour des marqueurs de pluripotence : OCT4 endogène, Nanog, Sox2 endogène, REX1, Dnmt3b et hTERT
- Formation de corps embryoïdes (16 jours de différenciation), extraction d’ARN, rétro-transcription et PCR classique pour des marqueurs de différenciation (3 marqueurs pour l’ectoderme, l’endoderme et le mésoderme)
- Extraction d’ARN, rétro-transcription et PCR classique pour des marqueurs vérifiant la présence des transgènes et du génome SeV
Module 3b : Caryotype moléculaire
Ce service s’étend sur environ 1 mois et inclut :
- Amplification de la lignée d'hiPSCs
- Extraction de l'ADN génomique
- Envoi de l'ADN au laboratoire Génome Québec
- Analyse des résultats
Module 3c : Empreinte génétique
Ce service s’étend sur environ 1 mois et inclut :
- Extraction d'ADN pour la lignée parentale
- Envoi de l'ADN au laboratoire Génome Québec
- Polymorphismes à répétition en tandem court (STR) pour 9 loci et Amelogenine
